Gènes cibles et gènes de référence spécifiques : un mariage unique pour des expériences de RT-PCR réussies
La PCR en temps réel est la méthode de choix pour mesurer le niveau d’expression de certains gènes. Mais ces mesures nécessitent des gènes de référence, appelés aussi gènes de ménage, ainsi que des analyses statistiques basées sur des méthodes mathématiques établies. L’identification de gènes de référence de confiance est nécessaire et cruciale pour une expérience réussie et reproductible.
Or, un gène de référence n’est pas universel !
Par exemple, on pense que les gènes de référence tels que l’actine, l’ubiquitine ou les gènes ribosomiques sont universellement requis pour les fonctions cellulaires de base et qu’ils sont exprimés de manière constitutive et stable dans des conditions physiologiques et expérimentales variables. Cependant, des travaux récents ont révélé que les niveaux d’expression de ces gènes de référence peuvent varier selon le type de cellule et les conditions expérimentales.
La sélection d’un gène de référence est basée sur la stabilité de son expression dans toutes les conditions expérimentales étudiées. Cette stabilité d’expression doit donc être vérifiée pour chaque nouvelle expérience programmée impliquant des conditions nouvelles. Identifier un tel gène n’est pas facile et il est nécessaire de tester plusieurs gènes candidats pour au final obtenir cet élément clé.
La stabilité de l’expression des gènes de référence est déterminée en utilisant la méthode M-Value de Vandesompele (Hellemans J et al. Genome Bio 2007). Dans ce cas, la mesure de stabilité des gènes, la M-Value, est définie comme l’écart type des valeurs d’expression transformées logarithmiquement des gènes comparés. Cet indice de stabilité et sa valeur décroissante donnent lieu au rang et à la stabilité du gène. Dans un premier temps, l’algorithme sélectionne une paire de gènes ayant la M-Value la plus faible, et les autres gènes sont classés en fonction du degré de compatibilité le plus élevé avec l’autre et avec une moyenne géométrique de la première paire. L’évaluation est réalisée sur la base des valeurs Ct et on calcule pour elles : la moyenne géométrique, la moyenne arithmétique, la valeur minimale et maximale, l’écart type et le coefficient de variation.
De plus, un nombre croissant d’institutions et de revues demandent aux scientifiques de présenter leurs résultats et les analyses qPCR en utilisant les directives MIQE (Minimum Information necessary for evaluating qPCR Experiments), qui exigent au minimum deux gènes de référence.
Explorer MaRS pour identifier et sélectionner des gènes de référence candidats
Depuis de nombreuses années, ACOBIOM identifie et sélectionne des gènes de référence pour réaliser les expériences de qPCR de ses clients, et pour développer ses propres diagnostics PCR axés sur les applications de médecine de précision.
Ainsi, dans une phase de pré-découverte, ACOBIOM détermine les gènes de référence les plus pertinents en fonction d’un tissu, d’une pathologie ou d’une évolution temporelle grâce à sa base de données unique de profils d’expression des gènes humains appelée MaRS (27 000 profils RNAseq calculés avec une seule méthode). Cette étape permet de sélectionner entre huit et douze gènes candidats selon la problématique. Puis, dans une seconde phase, ACOBIOM transfère ces gènes candidats de référence vers une plateforme de PCR en temps réel pour les valider. Ces deux étapes permettent l’identification et la validation de gènes de référence robustes et précis associés aux gènes cibles sélectionnés.
Ainsi, si les gènes cibles, souvent sélectionnés après de nombreuses analyses et études, sont considérés comme les Rois d’une expérience de RT-PCR, les gènes de référence sont les Reines de cette équation !
Pour faire de votre expérience de qPCR un succès, demandez à ACOBIOM d’organiser un mariage unique entre gènes cibles et gènes de référence !
